Kit RT-PCR (P4051, P4052)
Kit RT-PCR (P4051, P4052)
El kit RT-PCR está optimizado para sintetizar el ADNc de primera hebra a partir de poli (A) + purificado o ARN total. El kit RT-pcr para RT-PCR ofrece mayores rendimientos de ADNc, alta sensibilidad y transcripciones completas en un formato conveniente. Contiene todos los componentes que se necesitan para una síntesis exitosa de ADNc de primera hebra, lo que le ahorra tiempo y garantiza el éxito con cada experimento. El kit de transcriptasa inversa es una versión de M-MLV RT que ha sido diseñada para reducir la actividad de la RNasa H y proporcionar una mayor estabilidad térmica. La enzima se usa para sintetizar ADNc en un rango de temperatura de 42 a 55 ° C, lo que proporciona una mayor especificidad, mayores rendimientos de ADNc y más producto de longitud completa que otras transcriptasas inversas.
Componentes del Kit
| P4051 | P4052 | |
| M-MLV (200U/μl) | 20 μl | 100 μl |
| RNasin (40U/μl) | 12 μl | 60 μl |
| Oligo (dT) 15 (50μM) | 20 μl | 100 μl |
| Random hexamer primer (50μM) | 20 μl | 100 μl |
| 5x First-strand Buffer | 80 μl | 400 μl |
| RNase-free ddH2O | 1 ml | 1 ml x 5 |
| dNTPs (10 mM cada) | 50 μl | 250 μl |
Aplicaciones
Síntesis de ADNc de primera cadena para RT-PCR.
Construcción de bibliotecas de ADNc.
RT-PCR de un solo paso
Extensión de imprimación
Notas importantes
Evitar la contaminación por ribonucleasas
La pureza e integridad del ARN es esencial para la síntesis de ADNc de longitud completa. El ARN se puede degradar con ARNasa A, que es un contaminante muy estable que se encuentra en cualquier entorno de laboratorio. Todos los componentes del kit se han probado rigurosamente para garantizar que estén libres de ARNasa. Para evitar la contaminación, tanto el entorno del laboratorio como todas las soluciones preparadas deben estar libres de ARNasas. Recomendaciones generales para evitar la contaminación por ARNasa:
- Tratar con DEPC todos los tubos y puntas de pipeta que se utilizarán en la síntesis de ADNc o utilice material de laboratorio certificado sin nucleasas.
- Use guantes cuando manipule ARN y todos los reactivos, ya que la piel es una fuente común de ARNasas. Cámbiese los guantes con frecuencia.
- Utilice reactivos sin ARNasa, incluida agua de alta calidad (por ejemplo, agua tratada con DEPC).
- Utilice un inhibidor de la ARNasa, como la ARNasina, para proteger el ARN de la actividad de las ARNasas.
- Mantenga todos los componentes del kit sellados herméticamente cuando no estén en uso. Mantenga todos los tubos bien cerrados durante la reacción de transcripción inversa.
ARN Molde
El ARN celular total aislado por métodos estándar es adecuado para su uso con el kit. El ARN purificado debe estar libre de sales, iones metálicos, etanol y fenol para evitar inhibir la reacción de síntesis de ADNc. Las trazas de contaminantes pueden eliminarse mediante la precipitación con etanol del ARN seguido de dos lavados del sedimento con etanol frío al 75%. Para aplicaciones de RT-PCR, la plantilla de ARN debe estar libre de contaminación por ADN. Antes de la síntesis de ADNc, el ARN se puede tratar con DNasa I para eliminar trazas de ADN. DNasa I debe ser obtenido por el usuario. Realice siempre una reacción de control (RT-menos) que incluya todos los componentes para RT-PCR excepto la enzima transcriptasa inversa.
Digestión de RNasa H
La sensibilidad de la etapa de PCR se puede aumentar (especialmente para secuencias largas) eliminando el ARN molde de la molécula híbrida de ADNc: ARN mediante digestión con ARNasa H después de la síntesis de la primera hebra. La presencia de ARNasa H durante la síntesis de la primera hebra degradará el ARNm molde, lo que da como resultado una síntesis de cDNA de longitud completa disminuida y una disminución de los rendimientos de cDNA de la primera hebra.
Procedimiento de síntesis de ADNc de la primera hebra
La reacción de la primera cadena de ADNc se puede realizar como una reacción individual o como una serie de reacciones paralelas con diferentes ARN moldes. Por lo tanto, la mezcla de reacción se puede preparar combinando reactivos individualmente o se puede preparar una master mix que contenga todos los componentes excepto el ARN molde. Dependiendo de la estructura de ARN molde, los pasos separados para la desnaturalización del ARN y el anillamiento del cebador pueden mejorar los resultados de la RT-PCR.
Almacenamiento
Todos los componentes del kit deben almacenarse a -20 ° C. Mantenga el ARN de control a -70 ° C para un almacenamiento más prolongado.
Protocolo
| Cantidad | 20 preps (P4051), 200 preps (P4052) |
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