Miniprep para plásmidos de levaduras (D1081,D1082)
Miniprep para plásmidos de levaduras (D1081,D1082)
Esta miniprep está diseñada para la preparación de ADN plasmídico de levaduras de alta calidad de una forma rápida, económica y a pequeña escala. Este método se basa en el uso de columnas de centrifugación con membrana de sílice. Se requieren pocas manipulaciones, y es más rápido y sencillo de llevar a cabo en comparación con otros métodos orgánicos de extracción. Este ADN purificado es apto para todos los procesos comunes de biología molecular, incluyendo digestión por enzimas de restricción, clonación, secuenciación, etc.
Componentes
| Componentes | D1081 (50 preps) |
D1082 (100 preps) |
| ARNasa A | 150 μl | 300 μl |
| Solución YI | 15 ml | 30 ml |
| Solución YII | 15 ml | 30 ml |
| Solución YIII | 20 ml | 40 ml |
| Tampón de lavado PB | 30 ml | 50 ml |
| Tampón de lavado W | 30 ml | 30 ml x 2 |
| Tampón de elución | 5 ml | 10 ml |
| Columna de centrifugación | 50 unidades | 100 unidades |
Características
Alta pureza: A260/A280=1.7-1.9. Sin cloroformo o fenol, lo que es seguro para las personas.
Principio
Debido a la presencia de una pared celular más resistente a la presente en E.coli, el método de aislamiento de ADN plasmídico utilizando normalmente en la levadura Saccharomyces cerevisiae son más difíciles y producen un menor rendimiento de ADN en comparación con métodos de aislamiento de plásmidos bacterianos.
En nuestro protocolo, llevamos a cabo un paso inicial en el que se elimina la pared celular de la levadura para así obtener protoplastos de la levadura. A partir de los protoplastos, usamos el kit Yeast Plasmid DNA Purification kit para aislar el ADN plasmídico de la levadura.
Primero usamos una liticasa para digerir la pared celular de la levadura y obtener los protoplastos. Los protoplastos forman un pellet que es resuspendido y sujeto a lisis mediante SDS/alcalina para liberar el plásmido del ADN. El lisado resultante es neutralizado para crear las condiciones apropiadas para la unión del ADN plasmídico a la membrana de sílice de la columna de centrifugación. Los restos celulares y los precipitados de SDS forman un pellet por centrifugación, y el sobrenadante que contiene el ADN plasmídico es cargado en la membrana de la columna de centrifugación. El ADN adsorbido es lavado para eliminar contaminantes, luego se eluye con un pequeño volumen de tampón de elución (10 mM Tris-HCl, pH 8.5). El ADN plasmídico purificado está listo para su uso inmediato en procesos de biología molecular tales como digestión por enzimas de restricción, PCR, transformación y secuenciación automática.
Protocolo
| Nº de preparaciones | 50 preps (D1081), 100 preps (D1082) |
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