TAQ Polimerasa (P1011,P1012,P1013,P1014)

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La ADN polimerasa Taq está purificada a partir de un E.coli que expresa un clon del gen de la Thermus aquaticus. Esta enzima tiene una ADN polimerasa 5’ →3’ y una actividad exonucleasa 5’ →3’ pero carece de una actividad 3′ → 5′ exonucleasa. La enzima consta de un único polipéptido con un peso molecular aproximadamente de 94 kDa. La ADN polimerasa Taq es termoestable y sintetiza ADN a temperaturas elevadas a partir de moldes monocatenarios en presencia de un cebador.

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Aplicaciones

PCR estándar

Etiquetado de ADN

Secuenciamiento de ADN

Numerosas aplicaciones para las que se requiere una ADN polimerasa termoestable de alta calidad.

 

Definición de Unidades

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la incorporación de 10 nM de dNTPs en una forma ácida-insoluble en 30 minutos a 70ºC empleando esperma de arenque como sustrato.

 

Tampón de Almacenamiento

20mM TrisCl ( pH8.0), 100mM KCl, 3.2mM MgCl2 1mM DTT,0.1% Triton X-100 ,0.1% Tween20, 0.2mg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol

Tampón PCR 10X PCR con Mg2+

100mM Tris-HCL PH8.8,500mM KCl ,16mM MgCl2 ,1% Triton100

 

Notas

La ADN polimerasa Taq recombinante es la enzima elegida para la mayoría de las aplicaciones de PCR.

La vida media de la enzima es > 40 min a 95ºC.

La tasa de error de la ADN polimerasa Taq en la PCR es de 2,2×10-5 errores por nt por ciclo; la precisión (una inversa de la tasa de error), el número promedio de nucleótidos correctos incorporadas antes de cometer un error es de 4,5×10⁴.

La ADN polimerasa Taq acepta nucleótidos modificados (por ejemplo nucleótidos marcados con digoxigenina, biotina, fluorescentes) como sustratos para la síntesis de ADN. Es compatible con clonación TA – genera productos de PCR con adenina 3’ sobresaliente.

Recomendaciones con ADN molde en un volumen de reacción de 50 μl:

ADN genómico Humano 0,1 μg – 1 μg
ADN plasmídico 0,5 ng – 5 ng
ADN fago 0,1 ng – 10 ng
ADN genómico E.coli 10 ng – 100 ng

 

Protocolo Básico PCR
  1. Añade los siguientes componentes en un tubo de 50 μl de microcentrífuga estéril reposando sobre hielo:

 

Componentes Volumen Concentración Final
Tampón PCR 10X (Mg²⁺ Plus) 5 μl 1 X
dNTPs (2,5mM cada uno ) 4 μl 0,2 mM cada uno
Mix de Cebadores (10 μM cada uno) 2 μl 0,4 μM cada uno
ADN molde 1-10 μl n/a
ADN polimerasa Taq (5 U/μL) 0,1-0,5 μl 0,5-2,5 U
Agua destilada pasada por autoclave hasta 50 μl n/a
  1. Mezclar los contenidos del tubo y cubrir con 50 μl de aceite de silicona o mineral.
  2. Cerrar tubos y centrifugar un tiempo corto para recoger los contenidos en el fondo.
  3. Incubar tubos en un termociclador a 94ºC durante 3 minutos para desnaturalizar por completo el ADN molde.
  4. Llevar a cabo 35-35 ciclos de amplificaciçon de PCR como se indica:

 

Paso Temperatura Duración
Desnaturalización Inicial 94ºC 3 minutos
25-30 Ciclos 94ºC 30 segundos
55-68ºC 30 segundos
72ºC 1 minuto
Extensión final 72ºC 10 minutos
  1. Incubar 10 minutos adicionales a 72ºC y mantener la reacción a 4ºC. Las muestras se almacenan a -20ºC hasta su uso.

 

Notas sobre las condiciones de ciclado

La desnaturalización inicial se puede realizar en un intervalo de 1-5 minutos a 95ºC dependiendo del contenido de GC del molde.

La temperatura de anillamiento es 5ºC menor que la TM. Si se forman productos de PCR específicos se puede optimizar la temperatura de anillamiento aumentando 1-2ºC.

El número de ciclos de PCR depende de la cantidad de ADN molde en el mix de la reacción  y en el rendimiento esperado para el productor de PCR. 25-35 ciclos suelen ser suficientes para la mayoría de reacciones PCR. Bajas cantidades de ADN molde inicial puede que requieran 40 ciclos.

El tiempo de la extensión final puede ser extendido para amplicones que van a ser clonados en vectores TA.

  1. Analizar los productos de amplificación por electroforesis en gel de agarosa y visualice con tinción de bromuro de etidio. Use los estándares de peso molecular adecuados.

Almacenar todos los componentes a -20ºC.

 

U

500U sin dNTPs (P1011), 500U con dNTPs (P1012), 1000U sin dNTPs (P1013), 1000U con dNTPs (P1014)

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